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技術(shù)文章

免疫組化技術(shù)規(guī)范點(diǎn)擊次數(shù):2203 更新時(shí)間:2011-04-14

                                                       免疫組化技術(shù)規(guī)范

       www.cnedpu.com歐美國(guó)家相繼開展了免疫組化質(zhì)量控制工作,建立了一套比較完善的質(zhì)量控制方法和程序。中國(guó)病理工作者委員會(huì)(CCP)免疫組化研究中心借鑒國(guó)外的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合我國(guó)當(dāng)前的實(shí)際情況開始探索一種適合我國(guó)免疫組化質(zhì)控的方法,同時(shí),發(fā)現(xiàn)和推廣標(biāo)準(zhǔn)化的染色程序,改善和提高免疫組化實(shí)驗(yàn)的可靠性,使免疫組化技術(shù)更具標(biāo)準(zhǔn)化,免疫組化結(jié)果更具可靠性和重復(fù)性。盡管免疫組化在許多實(shí)驗(yàn)室中已常規(guī)開展,但它是一個(gè)多步驟、多因素決定的一種實(shí)驗(yàn)方法,由于各實(shí)驗(yàn)室采用的修復(fù)方法、染色方法、試劑廠家、抗體克隆號(hào)、檢測(cè)系統(tǒng)等有所不同,染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)較大差異,相當(dāng)部分的實(shí)驗(yàn)室對(duì)免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的認(rèn)識(shí)尚欠足夠重視, 致使不良的染色結(jié)果對(duì)病理診斷引起誤導(dǎo),因此免疫組化染色結(jié)果的可靠性受到了極大的關(guān)注。

 
       在實(shí)際工作當(dāng)中有許多因素影響著免疫組化的結(jié)果,包括技術(shù)人員是否熟練掌握整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作程序、抗體的特異性、方法的敏感性、標(biāo)本的固定、組織的處理、是否進(jìn)行抗原修復(fù)、修復(fù)液的PH值等等因素。為了讓每個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠持續(xù)穩(wěn)定地完成可靠的實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果,應(yīng)當(dāng)將免疫組化染色技術(shù)中的全部流程納入標(biāo)準(zhǔn)化。
 
   一、 免疫組化成功的要素
   病理科醫(yī)生要有相當(dāng)?shù)拿庖呓M化診斷知識(shí)和免疫組化技術(shù)經(jīng)驗(yàn),要清楚認(rèn)識(shí)免疫組化技術(shù)是一門實(shí)驗(yàn)性、技術(shù)性非常強(qiáng)的技術(shù),要多了解多種抗體在組織中的表達(dá)情況,以及影響免疫組化結(jié)果的各種因素,只有提高醫(yī)生的免疫組化診斷水平才能避免錯(cuò)誤的判斷,才能確保免疫組化診斷的準(zhǔn)確性。病理技術(shù)人員是免疫組化實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素,操作人員要有豐富的免疫組化的理論知識(shí)及熟練的免疫組化染色技術(shù),十分清楚每一個(gè)步驟的應(yīng)用原理,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性。可靠的實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)方法是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的*條件。由于實(shí)驗(yàn)方法多種多樣,抗體的品種繁多,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)當(dāng)確保高質(zhì)量?jī)r(jià)的試劑,并摸索出*的實(shí)驗(yàn)條件。的免疫組化取決于有效的抗原修復(fù)、敏感的檢測(cè)系統(tǒng)、合適的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控對(duì)照及熟練和有責(zé)任心的技術(shù)人員。
 
   二、免疫組化染色前處理技術(shù)操作規(guī)范
   1.取材:理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都認(rèn)為組織在加熱抗原修復(fù)過(guò)程中造成脫片的主要原因是取材過(guò)厚或脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。良好的取材、固定、脫水過(guò)程是免疫組化質(zhì)控的前提,如果H&E切片都做不出滿意的染色結(jié)果,那么免疫組化染色也將無(wú)從談起,根本無(wú)法保證染色質(zhì)量。
   2.固定:在眾多的組織固定液中(如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等),不同的實(shí)驗(yàn)方法在使用上各有千秋。但在保持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測(cè)定性、組織滲透性以及試劑的價(jià)格上,福爾馬林是、既經(jīng)濟(jì)又通用。而含酸或含汞的固定液對(duì)抗原保存均不理想。組織離體后固定一般不要超過(guò)30分鐘,在常溫條件下固定時(shí)間為8-24小時(shí)。同時(shí)還要注意避免福爾馬林過(guò)度固定造成的組織抗原丟失,有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過(guò)福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴(yán)重,抗原幾乎不能被檢測(cè),因?yàn)榻M織固定后會(huì)引起蛋白或蛋白分子之間形成交聯(lián),導(dǎo)致抗原位點(diǎn)遮蓋,可以通過(guò)抗原修復(fù)方法來(lái)修正,若加抗體前不采用抗原修復(fù),則免疫組化染色常不能到達(dá)理想結(jié)果或不成功。組織同樣不能長(zhǎng)時(shí)間放置在70%的乙醇中,酒精固定后的組織形態(tài)不如福爾馬林固定的組織。脫鈣液對(duì)抗原破壞較為嚴(yán)重,因此在組織脫鈣前在福爾馬林液中固定48小時(shí),若組織沒(méi)有固定透則酸會(huì)破壞抗原,脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時(shí)間都必須盡量控制在zui低的限度。
   3.浸蠟:我們認(rèn)為浸蠟溫度應(yīng)控制在58~60℃左右,浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換,以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆,細(xì)胞收縮,更容易掉片。
   4.切片厚度:用于免疫組織化學(xué)染色的切片厚度為3-4微米。為防止在染色過(guò)程中脫片,需要使用硅化玻片裱片。
   5.硅化玻片的制備:載玻片經(jīng)酸洗沖洗干凈后烤干; 2%APES丙酮或*中浸泡1~2min;丙酮或*洗1~2分鐘;蒸餾水浸洗1~2min;烤干備用。
   6.烤片:切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分鐘左右。有些實(shí)驗(yàn)室采用烤片過(guò)夜。有報(bào)導(dǎo)烤片溫度超過(guò)60℃時(shí),烤片時(shí)間超過(guò)18小時(shí)的切片,免疫組化染色強(qiáng)度比烤4小時(shí)的切片要略弱。溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均會(huì)影響抗原的活性,原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。
   7.切片保存:一些實(shí)驗(yàn)室研究人員習(xí)慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長(zhǎng)期保存在室溫條件下,切片后的組織在室溫下長(zhǎng)期保存抗原可以損失。邁新實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后,在室溫下保存三個(gè)月以上,免疫組化染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)減弱或陰性情況。并進(jìn)行了新、舊切片的保存時(shí)間對(duì)照實(shí)驗(yàn),選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片,共110片,常溫空氣中放置一個(gè)月、三個(gè)月、半年、一年與新切片進(jìn)行成對(duì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:組織蠟塊切片后在室溫下保存三個(gè)月,抗原對(duì)多數(shù)抗體的敏感性約下降一半,部分切片丟失更多。切片保存半年多數(shù)的抗體不能出現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)記結(jié)果,保存一年以上僅有個(gè)別的切片能夠有微弱的陽(yáng)性表達(dá),尤其核表達(dá)的抗原丟失更為突出。國(guó)外也有類似的資料報(bào)道。其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān),所以在實(shí)際工作可以采用蠟封切片來(lái)避免抗原損失以便長(zhǎng)期保存,也可4℃冰箱冷藏保存,尤其是用于科研集中實(shí)驗(yàn)的切片更應(yīng)注意切片的保存。
   8.脫蠟:免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同,免疫組化實(shí)驗(yàn)室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離,以保證脫蠟*,否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。
 
   三、免疫組化實(shí)驗(yàn)中的抗原修復(fù)
   1.酶消化:如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶
   2.抗原熱修復(fù):高壓法、微波法、水煮法
*,免疫組化染色中zui關(guān)鍵的莫過(guò)于抗原修復(fù),而絕大多數(shù)常用抗體的修復(fù)是通過(guò)加熱來(lái)完成的,熱抗原修復(fù)優(yōu)于酶消化,更有效,染色結(jié)果更易一致,操作單一。
   3.修復(fù)時(shí)間:既要獲得zui強(qiáng)的染色結(jié)果,又要保持組織形態(tài)的完整性。許多抗原修復(fù)存在的問(wèn)題是組織固定時(shí)間過(guò)短時(shí),強(qiáng)烈的抗原修復(fù)可引起形態(tài)破壞、脫片及組織*消化,解決的方法可采用較短時(shí)間的熱修復(fù)或減少酶的消化時(shí)間。
   4.抗原修復(fù)緩沖液:有檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0~9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等,檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)的優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰,適合于大多數(shù)抗體,Tris和 EDTA兩種修復(fù)液對(duì)部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng),但其染色背景同時(shí)加深,如使用不當(dāng)易造成假陽(yáng)性結(jié)果的判斷。目前還沒(méi)有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體,檸檬酸緩沖液(pH6.0)可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液,但也不能除外某些抗體適用于EDTA和EGTA緩沖修復(fù)液,一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇高pH值的修復(fù)液。例如:ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。
   5.抗原熱修復(fù)注意事項(xiàng):無(wú)論哪一步都不要讓切片干凅,加熱后需要冷卻15-30分鐘。充分的抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的*重要因素,加熱的溫度和時(shí)間可導(dǎo)致修復(fù)不足或過(guò)度修復(fù)。
   6.抗原熱修復(fù)對(duì)組織中內(nèi)源性生物素的影響:抗原熱修復(fù)在增強(qiáng)抗原決定簇表達(dá)的同時(shí),也增強(qiáng)了組織中內(nèi)源性生物素的反應(yīng)。采用卵白素-生物素(Avidin-biotin)檢測(cè)系統(tǒng),組織中內(nèi)源性生物素容易出現(xiàn)人為假象,在加熱抗原處理?xiàng)l件*相同的陰性對(duì)照片中可以觀察到較強(qiáng)的內(nèi)源性生物素的反應(yīng),沒(méi)有經(jīng)過(guò)熱抗原處理的切片中沒(méi)有出現(xiàn)類似的情況。在細(xì)胞漿中呈均一的細(xì)顆粒狀的淺棕色陽(yáng)性,有時(shí)表達(dá)也非常強(qiáng),與真陽(yáng)性的結(jié)果表達(dá)很相似,在以往的免疫組化染色中內(nèi)源性生物素的影響對(duì)診斷造成許多的誤差,卻常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚,陰性對(duì)照片必須與一抗的抗原修復(fù)處理?xiàng)l件*相同,才能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性生物素出現(xiàn)的部位。
   7.內(nèi)源性生物素封閉方法:一般在抗原修復(fù)以后,加抗體前使用卵白素進(jìn)行生物素阻斷處理,也可使用非生物素的檢測(cè)系統(tǒng),如:EliVision、EnVision、SuperVesion等。
 
   四、免疫組化染色實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范
   1.脫蠟:二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸餾水
   3.血清封閉:在加入一抗前需用二抗的正常血清進(jìn)行封閉,可以減少非特異性結(jié)合。目前使用的二步法檢測(cè)系統(tǒng)可以免去這一步驟。
   4.抗體使用:已有大量的即用型抗體供實(shí)驗(yàn)室使用,廠家已進(jìn)行過(guò)多次的實(shí)驗(yàn)檢測(cè),可按廠家提供的條件進(jìn)行操作。濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度,進(jìn)行對(duì)倍稀釋預(yù)實(shí)驗(yàn)。選定*的稀釋滴度后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。染色背景深大多是抗體濃度過(guò)高所致。抗體孵育溫度一般以常溫25℃為基準(zhǔn)或37℃30分鐘,也可4℃冰箱過(guò)夜。
   5.沖洗:常用的沖洗液為PBS或TBS緩沖液,要嚴(yán)格執(zhí)行沖洗步驟,防止因沖洗不凈引起的背景著色,緩沖液中加入Tween20可以增強(qiáng)沖洗效果。
   6.檢測(cè)系統(tǒng):通用的檢測(cè)系統(tǒng)有生物素標(biāo)記的ABC、SP、LSAB等,此類檢測(cè)系統(tǒng)較為經(jīng)濟(jì),日前仍有不少醫(yī)院在使用。非生物素類檢測(cè)系統(tǒng)價(jià)錢較貴,由于不需通過(guò)生物素的結(jié)合,可以避免內(nèi)源性生物素的干擾,其特點(diǎn):敏感、省時(shí)、方便、背景低。
   7.顯色系統(tǒng):由于檢測(cè)系統(tǒng)采用的是辣根過(guò)氧化物酶,因此選擇DAB(棕色)和AEC(紅色)作為酶的底物,若采用堿性磷酸酶系統(tǒng)則選擇BCIP/NBT(藍(lán)紫色),常規(guī)免疫組化顯色的仍然是DAB,定位清晰,易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低,BCIP/NBT陽(yáng)性雖鮮艷,但陽(yáng)性定位不準(zhǔn)確。
   8.復(fù)染:襯染步驟十分簡(jiǎn)單,但襯染的好壞對(duì)染色zui終結(jié)果的質(zhì)量影響很大。有的選用Harris蘇木素,有的用Mayer’s蘇木素,且與DAB染色對(duì)照效果,在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中使用簡(jiǎn)單方便。也有實(shí)驗(yàn)室使用甲基綠襯染襯染,但不能經(jīng)有機(jī)溶劑,容易退色。
 
   五、染色結(jié)果的觀察
   1.陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞相應(yīng)的部位,在細(xì)胞膜表達(dá)的抗原陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞膜上,在其他部位
的陽(yáng)性反應(yīng)均為非特異性染色。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會(huì)導(dǎo)致抗原在組織細(xì)胞中定位的改變。根據(jù)所檢測(cè)抗原的不
同,抗原分別定位在:
(1)細(xì)胞膜:如LCA和CD3、CD20等;
(2)細(xì)胞質(zhì):如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等;
(3)細(xì)胞核:如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。
   2.組織的周邊、氣泡、刀痕、皺折等部位往往呈現(xiàn)非特異性陽(yáng)性表達(dá)。
   3.染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達(dá),要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。
   4.組織切片背景深與下列因素有關(guān):
(1)石蠟切片脫蠟不干凈;
(2)*抗體濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),溫度過(guò)高;
(3)顯色劑DAB濃度過(guò)高或H2O2太多;
(4)抗體不純;
(5)抗體孵育后切片清洗不干凈。
 
   六、免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)照
   為證實(shí)抗體和檢測(cè)試劑盒效價(jià)是否可靠,染色操作是否正確,一般需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)照,以避免試劑失效或操作失當(dāng)而出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性,確保染色結(jié)果的可靠性。
   1.陽(yáng)性對(duì)照:選用已知染色中度陽(yáng)性以上的組織切片染色,陽(yáng)性切片應(yīng)呈陽(yáng)性,此外組織中的內(nèi)對(duì)照也是很好的陽(yáng)性對(duì)照。
   2.陰性對(duì)照:選用已知染色陰性的組織切片染色,其結(jié)果應(yīng)為陰性。每次實(shí)驗(yàn)中增加Vimentin染色作為對(duì)照,目的是觀察組織經(jīng)福爾馬林固定后預(yù)期抗原表達(dá)的敏感性,按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來(lái)進(jìn)行分析。Vimentin幾乎在任何組織中都有表達(dá),尤其適合活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管Vimentin可陽(yáng)性表達(dá),如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)Vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r,表明是不當(dāng)?shù)墓潭▽?dǎo)致抗原破壞。所以在每批次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)常規(guī)加入Vimentin染色,用于指導(dǎo)觀察福爾馬林固定后抗原表達(dá)敏感性情況。
 
   七、抗體的保存和稀釋
   一般來(lái)說(shuō),抗體應(yīng)放在4℃冰箱中保存,*抗體可分成小包裝于-20℃保存,使用時(shí)存放在4℃,不宜反復(fù)存放于4℃和-20℃之間,反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)下跌。檢測(cè)系統(tǒng)一般不宜于-20℃保存,因?yàn)榉磸?fù)凍融使得與抗體結(jié)合的酶容易分解,導(dǎo)致檢測(cè)的敏感度降低。濃縮的抗體在染色前應(yīng)根據(jù)說(shuō)明書要求或自行摸索出的*工作濃度進(jìn)行稀釋。可將抗體稀釋至1:10,染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時(shí)間較長(zhǎng),反之稀釋后的抗體保存的期限較短,如使用即用型抗體,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后應(yīng)注意其效價(jià)時(shí)否有所降低,避免出現(xiàn)假陰性染色。
   Nestin、PDGFR 可用于胃腸間質(zhì)瘤的診斷指標(biāo),尤其對(duì)CD117陰性胃腸間質(zhì)瘤在診斷上有很大的幫助,在國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。這兩種抗體可用于常規(guī)固定的石蠟切片,經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明Nestin 用PH8.0 EDTA高壓修復(fù),PDGFR用PH6.0 檸檬酸微波修復(fù)效果較好。


 

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