用elisa試劑盒檢測樣本的原理和步驟

ELISA法定量檢測人細胞液、體液以及組織勻漿中8羥基脫氧鳥苷的含量。

試劑組成

包被平底微孔板,酶結合物,生物素,標準品,顯色劑A,顯色劑B,終止液,濃縮洗滌液（100倍稀釋）,使用說明書

自備物品

1.酶標儀（盡量提前預熱）

2.微量加液器、吸頭

3.蒸餾水或去離子水以及濾紙

樣本的采集及保存

一般的生物標本包括有：

血液、體液、內臟器官、糞便、胃液、活檢組織、組織提取液、天然孔分泌物及各種表達系統的表達產物等

一般為無菌操作，低溫保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的實質器官則要求：

1、   器官實質不能太小

2、   以采集實質性病灶區為佳：如淋巴結、心臟、非、肺、脾以及腸管等病毒、病菌聚集的地方為佳

3、   同一病例裝入同一容器，并做好標記

4、   應在0-8℃的低溫儲存和運輸

5、   實質性器官的處理：

5.1、取實質性器官約0.5mg左右，充分剪碎或研磨

5.2、加入約500ul的PBS/生理鹽水，充分混勻

5.3、離心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作為待檢標本（切勿反復凍融）

二．體液（常見的包括血清、血漿、唾液以及尿液等）的處理方式

1、血液包括血漿和血清，它們的主要區別就是：血清凝血而血漿不凝血，所以它們的處理方式也就不一樣

1.1、采集血漿時一般不加抗凝劑（主要為枸櫞酸鹽和檸檬酸鹽），采集后立即離心800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存備用；

1.2、如要采集血清，一般要加入總體積1%的抗凝劑，采集后先室溫或4℃靜置半小時后，800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存備用；

2、胃液和唾液的采集方式一般現采現用，但是一般飯后半小時內不易采集，因為剛進食的唾液中富含豐富的唾液淀粉酶，的采集的時間時空腹采集；

3、尿液的采集方式基本和唾液一樣的，即現采現用，但是一般隔夜尿不采集；

4、組織提取液如肺泡灌洗液等，采集后離心分離，800-1000rmp x 5min，取上清，-20℃或4℃保存備用；

三．糞便以及天然孔排泄物：采集后一般現用PBS/生理鹽水溶解，充分混勻，800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存備用；

四．活檢組織一般進行穿刺檢測，zui常見的就是肝活檢，像病毒性肝炎、脂肪肝、各種類型的肝硬化等進行活檢簡單方便、準確。

三、表達產物的檢測

（一）真核表達產物

1、   細胞上清（分泌性蛋白）

1.2、貼壁細胞或半貼壁，直接將細胞培養上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20℃或4℃保存，作為標本進行檢測，如有需要可進行透析或純化處理；

1.2、不貼壁細胞，將培養基和細胞轉移至10ml離心管，500-800rmp x10min，吸取上清至另一10ml離心管中，10000rmp x10min， -20℃或4℃保存，作為標本進行檢測，如有需要可進行透析或純化處理；

2、   細胞裂解物（非分泌性蛋白）

2.1、貼壁細胞或半貼壁，直接將細胞培養上清吸出，然后用001M PBS（pH 7.4）將細胞吹下至10ml離心管，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀轉移至1.5ml離心管中， DDW重懸，置冰水浴中用超聲波裂解儀進行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20℃或4℃保存，作為標本進行檢測，如有需要可進行透析或純化處理；

2.2、不貼壁細胞，將培養基和細胞轉移至10ml離心管，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀移至另一10ml離心管中，0.01M PBS（pH 7.4）重懸，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀移至1.5ml離心管中， DDW重懸，置冰水浴中用超聲波裂解儀進行裂解，10000rmp x10min，取上清， -20℃或4℃保存，作為標本進行檢測，如有需要可進行透析或純化處理；

（二）原核（大腸桿菌表達系統）表達產物

1、表達上清（非融合性蛋白）

直接將培養物和上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20℃或4℃保存，作為標本進行檢測，如有需要可進行透析或純化處理；

2、菌體裂解物（融合性蛋白）

直接將培養物和上清吸出，10000rmp x10min，棄上清，沉淀用PBS洗一遍，500-800rmp x10min，棄上清，DDW重懸沉淀，冰水浴中用超聲波裂解儀進行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20℃或4℃保存，作為標本進行檢測，如有需要可進行透析或純化處理；

注意事項

1.試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存。實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2．加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免*孔與zui后一孔之見的時間間隔過大，否則將會導致不同的預孵育時間，從而影響實驗的準確性以及重復性；一般加樣時間控制在10分鐘內，如果樣本數量過多，可使用多道移液器。

3.孵育：樣品要在密閉的容器內進行孵育，嚴格按照說明書上規定的孵育時間和溫度進行。

4.洗滌：洗滌過程中反應孔中的殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干，同時要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響zui后的酶標儀讀數。

5.反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，10分鐘左右），如果顏色較深，請提前加入終止液終止反應。

6.建議實驗前預測樣品含量，如樣品濃度過高，應對樣品進行稀釋，計算結果時乘以相應的稀釋倍數。

7.建議使用本試劑盒時先做預實驗（即先做標準曲線，試用幾個標本），如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經銷商，如果因運輸過程導致試劑盒失效，可要求調換，但概不承擔產品本身以外的任何損失。

操作步驟

1.          取出試劑盒，于室溫（20-25℃）放置15-30分鐘。實驗過程應在室溫（20-25℃）內進行。

2.          取出酶標板，按照標準品的次序分別加入50μl的標準品溶液于空白微孔中。

3.          空白微孔中加入50μl的樣品，空白對照加入50μl的蒸餾水；

4.          在樣品孔中加入10μl的生物素；（不含空白對照孔,切忌：生物素只加樣品孔！）

5.          在各孔中加入100μl的酶標記溶液；（不含空白對照孔）

6.          將酶標板用封口膠密封后，37℃孵育反應 1小時；（在孵育箱中保持穩定的溫度與濕度）

7.          充分清洗酶標板3-5次，保持各孔有充足的水壓；（濃縮洗滌液以1：100的比例與蒸餾水稀釋）

8.          酶標板洗滌后用吸水紙*拍干；

9.          各孔加入顯色劑A、B液各50μl；（不含空白對照孔）

10.       20-25℃下避光反應15分鐘；

11.       各孔加入50μl終止液，終止反應；

結果判斷

1.          30分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值；

2.          以OD值為縱坐標，以標準品的濃度為橫坐標，繪制曲線圖；

3.          根據樣品的OD值查找對應的濃度范圍；

4.          敏感度：0.1 ng/ml